Biofilms microbiens en tant que photoconducteurs vivants grâce au transfert d'électrons ultrarapide dans les nanofils de cytochrome OmcS

Nature Communications volume 13, Numéro d'article : 5150 (2022) Citer cet article

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Le transfert d'électrons microbien induit par la lumière offre un potentiel de production efficace de produits chimiques à valeur ajoutée, de biocarburants et de matériaux biodégradables grâce à des voies métaboliques diversifiées. Cependant, la plupart des microbes manquent de protéines photoactives et nécessitent des photosensibilisateurs synthétiques qui souffrent de photocorrosion, de photodégradation, de cytotoxicité et de génération de radicaux photoexcités nocifs pour les cellules, limitant ainsi considérablement les performances catalytiques. Par conséquent, il existe un besoin pressant de matériaux photoconducteurs biocompatibles pour une interface électronique efficace entre les microbes et les électrodes. Ici, nous montrons que les biofilms vivants de Geobacter sulfurreducens utilisent des nanofils de cytochrome OmcS comme photoconducteurs intrinsèques. La microscopie à force atomique photoconductrice montre une augmentation jusqu'à 100 fois du photocourant dans les nanofils individuels purifiés. Les photocourants répondent rapidement (<100 ms) à l'excitation et persistent de manière réversible pendant des heures. La spectroscopie d'absorption transitoire femtoseconde et les simulations de dynamique quantique révèlent un transfert d'électrons ultrarapide (~ 200 fs) entre les hèmes de nanofils lors de la photoexcitation, améliorant la densité et la mobilité des porteurs. Nos travaux révèlent une nouvelle classe de photoconducteurs naturels pour la catalyse cellulaire entière.

Les cellules vivantes sont incorporées à des points quantiques et à des nanostructures pour le marquage fluorescent et l'administration de médicaments depuis plus de deux décennies1. Cependant, les nanostructures absorbant la lumière n'ont pas été utilisées pour provoquer des réactions catalytiques à l'intérieur des cellules en raison du manque de biocompatibilité et de la cytotoxicité élevée des matières étrangères, telles que les photosensibilisateurs, à l'intérieur de la cellule, ce qui limite souvent l'efficacité opérationnelle1. De plus, les défauts inhérents aux photosensibilisateurs synthétiques causent plusieurs problèmes tels que la photocorrosion, la photodégradation et la génération de radicaux photoexcités, ce qui entraîne une faible stabilité, une non-reproductibilité et un manque de durabilité des matériaux biohybrides2.

Certaines bactéries produisent des centres absorbant la lumière mais souffrent d'une faible efficacité de transfert d'électrons et d'un manque de durabilité1. Les protéines naturelles de transfert d'électrons telles que les azurines, la myoglobine et les cytochromes de type c ne présentent pas de photoconductivité3,4 en raison de la durée de vie des porteurs picosecondes du fer héminique qui inhibe généralement toute séparation de charge5. La liaison covalente de photosensibilisateurs artificiels à ces protéines donne un faible taux de transfert d'électrons sur l'échelle de temps de 10 ns ou plus lent, ce qui limite considérablement leurs applications6. De plus, il n'est pas possible d'utiliser des durées de vie d'état excité plus longues, telles que l'injection d'électrons à partir des états triplets en raison de la dégradation rapide causée par les espèces réactives de l'oxygène produites dans ces processus. Par conséquent, il est urgent de développer de nouveaux biomatériaux capables d'un transfert d'électrons primaires ultrarapide pour obtenir une séparation de charge efficace, suivi d'un transfert d'électrons secondaire séquentiel pour une séparation de charge et une accumulation de charge à longue durée de vie6.

Pour évaluer l'utilisation de matériaux vivants modifiés comme photoconducteurs vivants, nous avons choisi l'organisme électroactif du sol Geobacter sulfurreducens car il a développé la capacité d'exporter des électrons, dérivés du métabolisme, vers des accepteurs extracellulaires tels que des oxydes métalliques et des électrodes dans un processus appelé transfert d'électrons extracellulaire. (EET)7,8. Les bactéries établissent un contact électrique direct avec les accepteurs d'électrons via des nanofils de cytochrome polymérisés d'un micromètre de long, appelés OmcS, qui éliminent le besoin de médiateurs redox diffusifs7,8 (Fig. 1b). Les hèmes dans le nanofil OmcS forment une paire parallèle empilée, chaque paire étant perpendiculaire (empilée en T) à la paire suivante, formant une chaîne continue sur toute la longueur micrométrique du nanofil7 (Fig. 1d). Les distances minimales bord à bord sont de 3,4 à 4,1 Å entre les hèmes empilés en parallèle et de 5,4 à 6,1 Å entre les paires empilées en T.

un schéma de mesure. Les biofilms sont cultivés sur des électrodes transparentes en oxyde d'étain dopé au fluor (FTO). b Microscopie électronique à transmission de cellules CL-1 produisant des nanofils OmcS. Barre d'échelle, 200 nm. c Image de hauteur AFM d'un seul nanofil OmcS sur mica (à gauche) et profil de hauteur respectif (à droite) indiqué là où la ligne rouge est indiquée. Barre d'échelle 50 nm. d Les hèmes dans OmcS s'empilent de manière transparente sur toute la longueur micrométrique des nanofils. Les distances bord à bord sont en Å. e Spectroscopie UV-Visible du biofilm sur électrode FTO avec la longueur d'onde d'excitation de 408 nm marquée par un triangle violet. f Réponse de tension actuelle du biofilm avec le laser allumé et éteint. Le pourcentage d'augmentation de la valeur de conductance représente la moyenne ± l'écart type (SD). de deux répliques biologiques. Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source.

Grâce à cette structure de nanofils OmcS optimisée pour l'évolution avec un empilement homogène d'hèmes, G. sulfurreducens peut transférer des électrons sur des distances cent fois leur taille en formant des réseaux de nanofils hautement conducteurs de plus de 100 µm d'épaisseur dans des biofilms9,10, ce qui permet à G. sulfurreducens pour générer la densité de courant la plus élevée dans les systèmes bioélectrochimiques11. En raison de leur grande capacité de stockage d'électrons, les cytochromes confèrent également une supercapacité élevée aux biofilms avec une faible autodécharge et une charge/décharge réversible12. De plus, un réseau de nanofils purifiés peut transférer des électrons sur des distances de 10 000 fois la taille d'une cellule9. Par conséquent, G. sulfurreducens sert de système modèle idéal pour l'électrocatalyse, la corrosion des métaux et la production de carburants13,14. On pensait auparavant que les filaments conducteurs à la surface de G. sulfurreducens sont des pili15 et qu'un réseau de pili confère une conductivité aux biofilms de G. sulfurreducens10,13,16. Cependant, des études de localisation structurelle, fonctionnelle et subcellulaire ont révélé que les nanofils à la surface bactérienne sont composés de cytochromes7,8 alors que les pili restent à l'intérieur de la cellule pendant l'EET et sont nécessaires à la sécrétion de nanofils de cytochrome à la surface bactérienne17,18.

Les nanofils pourraient être répandus et leurs propriétés photophysiques pourraient être physiologiquement importantes car de nombreuses bactéries réductrices de métaux de type Geobacter forment des biofilms hautement conducteurs19,20 et sont largement distribuées à la surface de la terre dans des sédiments peu profonds qui contiennent une lumière solaire abondante et des oxydes métalliques21,22,23 . Les sédiments sont capables de transporter des électrons sur des centimètres24 et peuvent convertir la lumière incidente en électricité25. Il a été démontré que l'éclairage de la lumière visible sur les cellules de G. sulfurreducens améliore leurs performances catalytiques, telles que l'augmentation du transfert d'électrons métaboliques vers les oxydes métalliques26 ou d'autres matériaux semi-conducteurs de plus de 8 fois par rapport à celle observée dans des conditions sombres21. De plus, le transfert d'électrons bactérien induit par la lumière était bien corrélé avec les taux de respiration microbienne et de consommation de substrat26. Cependant, le mécanisme moléculaire et physique sous-jacent de cette performance photocatalytique accrue est resté incertain.

En plus de la catalyse de cellules entières induite par la lumière21,26, l'expression artificielle du cytochrome OmcS dans les cyanobactéries photosynthétiques, l'augmentation des performances catalytiques dans divers processus tels qu'une augmentation du photocourant de 9 fois27, une augmentation de la fixation de l'azote de 13 fois28 et une photosynthèse améliorée en raison d'une augmentation de 60 % de la biomasse29 par rapport aux cyanobactéries de type sauvage. Ces études mettent en évidence le rôle vital d'OmcS dans la biocatalyse par la lumière. Cependant, les propriétés photophysiques intrinsèques d'OmcS, qui pourraient expliquer ces améliorations catalytiques, n'ont pas été étudiées.

Sur 111 cytochromes chez G. sulfurreducens, OmcS est le seul cytochrome formant des nanofils essentiel pour les oxydes EET à Fe(III) abondants dans le sous-sol14. En effet, les cytochromes abondants dans le sous-sol lors de la bioremédiation de l'uranium fonctionnent de manière similaire à OmcS30. OmcS est également important pour EET aux électrodes pendant les étapes initiales de la croissance du biofilm14. OmcS est également requis pour le transfert d'électrons interspécifiques dans les cocultures de Geobacter afin de réaliser la "syntrophie électrique"13,31,32. Ce transfert d'électrons interespèces via des consortiums microbiens naturellement conducteurs est important dans divers environnements méthanogènes et consommateurs de méthane qui affectent le climat mondial33,34,35. Il a également été démontré que les espèces bactériennes photosynthétiques effectuent une syntrophie électrique avec conversion du CO2 par la lumière en produits chimiques à valeur ajoutée2. Cependant, les composants et les voies responsables d'une telle biocatalyse induite par la lumière n'ont pas été identifiés et le potentiel de photoactivité au-delà des micro-organismes photosynthétiques reste largement inconnu.

Nous avons émis l'hypothèse que les nanofils de cytochrome dans les biofilms pourraient être photoactifs, permettant une interface électronique efficace entre les microbes et les électrodes. Ici, nous montrons que les biofilms vivants de Geobacter sulfurreducens utilisent des nanofils de cytochrome OmcS comme photoconducteurs intrinsèques. Étonnamment, les nanofils présentent une photoconductivité avec un transfert d'électrons hème à hème ultra-rapide et sub-picoseconde, ce qui pourrait expliquer leur influence sur les performances photocatalytiques mentionnées ci-dessus. Ces taux sont parmi les plus élevés pour le transfert d'électrons à l'état excité en biologie36.

Pour déterminer le rôle des nanofils OmcS dans le transfert d'électrons induit par la lumière, nous avons utilisé la souche CL-1 de G. sulfurreducens génétiquement modifiée, car elle surexprime les nanofils OmcS (Fig. 1b – d) et forme des biofilms hautement conducteurs et cohésifs qui peuvent être facilement transférés. à plusieurs surfaces37 (Fig. 1a). Lors de la photoexcitation laser (λ = 408 nm) spécifique à la bande de Soret des hèmes de type c4, la conductance du biofilm est restée ohmique et a augmenté de 72 ± 21% (Fig. 1e, f). Ces études montrent que les biofilms vivants de G. sulfurreducens peuvent servir de photoconducteurs intrinsèques. Comme la conductivité du biofilm détermine le taux bactérien d'EET11, nos résultats pourraient expliquer l'augmentation des performances photocatalytiques de G. sulfurreducens21,26.

Pour déterminer l'origine de la photoconductivité dans les biofilms, nous avons purifié des nanofils de la souche CL-1 (Fig. 2a). Le spectre d'absorbance ultraviolet-visible (UV-Vis) des nanofils a montré une forte bande de Soret à 410 nm pour les nanofils oxydés à l'air (Fig. 2b). Les nanofils ont été complètement oxydés dans ces conditions car l'ajout d'oxydant (ferricyanure) n'a pas modifié le spectre (Fig. 1a supplémentaire). Nous avons placé les nanofils sur des électrodes d'or interdigitées et éclairées par le haut (puissance laser = 100 mW/cm2). La photoconductance du réseau de nanofils a initialement augmenté de plus de 6 fois (Fig. 2c), mais l'ampleur de l'augmentation de la conductance a diminué avec le temps, probablement en raison des dommages causés par le laser. Les nanofils ont répondu plus rapidement que 100 ms (encadré Fig. 2c). La photoréponse a persisté pendant des heures mais a diminué avec le temps (Fig. 2c). Le courant d'obscurité et le photocourant étaient tous deux proportionnels à une tension appliquée allant de -0, 2 à + 0, 2 V (Fig. 2d), indiquant un comportement de conduction ohmique des nanofils similaire aux biofilms. Remarquablement, les réseaux de nanofils, avec et sans excitation laser, ont montré une réponse linéaire courant-tension avec une augmentation moyenne de la conductance de 230 ± 28 % (n = 7), ce qui est plus élevé que les perovskites38,39 et les nanofils de porphyrine40 (Fig. 2d, e).

un gel de coloration Heme de nanofils montrant une seule bande d'OmcS. b Spectre UV-Vis des nanofils oxydés (vert) et réduits (rouge). c Réponse photocourant du réseau de nanofils à 200 mV avec la décroissance actuelle de l'état bloqué soustraite. Encart : photoréponse rapide (<100 ms) des nanofils. Les axes sont les mêmes que sur la Fig. 2c. d Réponse courant-tension du réseau de nanofils et du cytochrome c pour comparaison e Comparaison de la conductance du réseau de nanofils avec le laser allumé ou éteint. Les valeurs représentent la moyenne ± erreur standard de la moyenne (SEM) avec des points de données individuels représentés par des points gris (n = 7 expériences indépendantes). ** indique la valeur p = 0,003 en utilisant un test t apparié à deux queues. f Schéma de pc-AFM de nanofils individuels. g Réponse courant-tension d'un nanofil individuel avec un ajustement linéaire représenté par une ligne pointillée violette. h Comparaison de l'augmentation de la conductance lors de la photoexcitation dans des nanofils individuels. Les valeurs représentent la moyenne de toutes les courbes courant-tension mesurées sur des nanofils individuels (le nombre de courbes varie de 10 à 120 Tableau supplémentaire 2). i Comparaison de la conductance moyenne des nanofils individuels avec laser allumé ou éteint. Les valeurs représentent la moyenne ± SEM avec des points de données individuels représentés par des points gris (n = 15 expériences indépendantes). ** indique la valeur p = 0,007 en utilisant un test t apparié à deux queues. Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source.

Plusieurs expériences de contrôle ont confirmé que la photoconductivité observée est une propriété intrinsèque des nanofils, en raison de leur architecture cytochrome polymérisée. Par exemple, le cytochrome-c monomère de cœur de cheval a montré un courant d'obscurité et un photocourant très faibles comme prévu3,4 lorsqu'il est mesuré dans des conditions identiques (Fig. 2d). Lors de l'ajout d'un dithionite de sodium réducteur chimique, la bande de Soret pour les nanofils réduits s'est déplacée vers le rouge à 420 nm comme prévu4 (Fig. 2b). Ces nanofils chimiquement réduits (λSoret = 420 nm) n'ont pas montré de photoconductance significative lors de l'excitation à λ = 405 nm, confirmant que la photoréduction des hèmes oxydés est nécessaire pour la photoconductivité dans les nanofils à cette excitation (Fig. 1b supplémentaire). Le passage du matériau d'électrode de l'or au tungstène a également conservé la photoconductivité, confirmant que la réponse mesurée n'est pas un artefact du matériau d'électrode (Fig. 2 supplémentaire). Le rapport du courant laser-on/laser-off (on/off) des nanofils a augmenté avec l'augmentation de la puissance laser, démontrant en outre que la photoconductivité mesurée est uniquement due à l'excitation laser (Fig. 3 supplémentaire). Toutes ces expériences confirment ensemble que les nanofils présentent une photoconductivité intrinsèque qui peut expliquer la photoconductivité observée dans les biofilms vivants. La différence de photoconductivité entre les biofilms et les nanofils purifiés est probablement due aux matériaux non conducteurs tels que les cellules et les polysaccharides présents dans les biofilms.

Pour quantifier la photoréponse de nanofils individuels, nous avons utilisé la microscopie à force atomique photoconductrice (pc-AFM)41 (λ = 405 nm, puissance laser initiale = 3,20 kW/cm2, Fig. 2f). Les nanofils individuels ont montré une augmentation jusqu'à 100 fois de la conductance lors de la photoexcitation (Fig. 2h – i, tableau supplémentaire 2). Les différences de photoconductance sont probablement dues à la variation de la puissance laser due à la configuration expérimentale (voir les méthodes et la Fig. 11 supplémentaire pour plus de détails). La différence de photoconductivité entre les nanofils individuels et le réseau de nanofils est probablement due à la résistance de contact inter-nanofil ainsi qu'à la résistance de contact nanofil-électrode. Notamment, l'augmentation observée de 10 à 100 fois de la conductance pour les nanofils de protéines à un biais relativement faible (<0,5 V) est nettement supérieure à celle des porphyrines synthétiques42 qui ne montrent qu'une augmentation jusqu'à 5 fois à un biais très élevé de 12 V.

Ces expériences sur des nanofils individuels confirment que la réponse de photoconductivité observée dans les réseaux de nanofils est due aux nanofils seuls et non à un artefact de la configuration de mesure. De plus, la photoconductivité observée n'est pas due à des effets de chauffage car toutes les expériences pc-AFM ont été réalisées dans un environnement à température contrôlée, inhibant ainsi toute augmentation substantielle de la température. De plus, la linéarité et la stabilité de nos courbes IV indiquent que l'augmentation de la conductivité mesurée n'est pas due au chauffage (Fig. 2g). De plus, la conductivité des nanofils OmcS diminue lors du chauffage43 alors que nous avons observé une augmentation jusqu'à 100 fois de la conductivité lors de la photoexcitation.

Pour comprendre le mécanisme de la photoconductivité dans les nanofils de protéines, nous avons effectué une spectroscopie d'absorption transitoire femtoseconde (fs-TA) en déterminant la dynamique des électrons lors de la photoexcitation sur une échelle de temps ultrarapide (~ 100 fs)5,44 (Fig. 3a). Le fs-TA suit les changements spectraux UV-Vis en modifiant le délai Δτ entre la pompe laser femtoseconde et les impulsions de la sonde et en enregistrant un spectre d'absorbance différentielle (ΔA) à chaque délai44 (Fig. 3a). Ce spectre de différence contient des informations sur les processus dynamiques se produisant dans le système tels que la migration d'énergie à l'état excité, les processus de transfert d'électrons ou de protons et l'isomérisation44. Contrairement aux études ci-dessus de la photoexcitation dans la bande Soret (Fig. 1, 2), nous avons effectué fs-TA en utilisant l'excitation dans la bande Q (λ = 545 nm) pour éviter les dommages thermiques et pour surveiller les changements dans la région. des bandes d'absorption les plus fortes44. Il est important de noter que les transitions de Soret et de la bande Q proviennent du même état fondamental, ce qui fait de l'excitation de la bande Q un proxy approprié pour surveiller ces processus44. La photoexcitation avec λ = 530, 545 et 400 nm a donné une dynamique similaire, démontrant une large gamme spectrale pour la photoconductivité (Figs. 4, 5 supplémentaires). Ni le tampon seul ni le substrat vierge n'ont montré de réponse, les mesures à l'état solide et liquide sont similaires et la dynamique ET était indépendante de l'intensité et de la puissance du laser (Figs. 6, 7, 8 supplémentaires) indiquant que la dynamique observée est due aux nanofils et non un artefact de l'environnement ou du substrat.

un schéma de fs-TA. Un faisceau pompe (λ = 545 nm) excite un échantillon de nanofils et est suivi d'un faisceau sonde après une temporisation. L'absorption différentielle entre les spectres initial et différé est détectée et rapportée sous forme de densité optique. b Données d'absorption transitoire moyenne des nanofils (n = 6 expériences indépendantes) où les couleurs représentent la milli densité optique (mOD). c Changement normalisé de l'absorption différentielle avec la longueur d'onde à différents temps de retard. Les longueurs d'onde clés sont marquées comme λ = 410 nm (vert), λ = 424 nm (rouge) et λ = 367 nm (bleu). d Les spectres expérimentaux (solides) et simulés (en pointillés) de nanofils oxydés, réduits et singulet doublement oxydés. Les marqueurs de longueur d'onde sont les mêmes que sur la figure 3c. e Changement normalisé de l'absorption différentielle sur le temps de retard aux longueurs d'onde clés. Les marqueurs de temps sont affichés dans la même couleur que les traces de temps sur la figure 3c. Les traces dans c et e représentent la moyenne de n = 6 expériences indépendantes. Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source.

Lors de la photoexcitation des nanofils de protéines, les électrons sont promus de l'état fondamental à l'état excité, ce qui diminue la population de l'état fondamental. Cette diminution a provoqué un signal négatif dans ΔA à 410 nm connu sous le nom de blanchiment à l'état fondamental44 (Fig. 3b, c). De plus, nous avons observé un ΔA positif qui indique une absorption à l'état excité à λ = 367 nm et λ = 424 nm après Δτ = 0, 1 ps et 2 ps, respectivement (Fig. 3c, d). Ces absorptions sont absentes dans les nanofils natifs, oxydés à l'air et non excités (Fig. 3d), ce qui indique que la photoexcitation est à l'origine de ces absorptions. En particulier, l'absorption à λ = 424 nm correspond bien à l'absorption de nanofils chimiquement réduits (Fig. 3d), ce qui suggère que lors de la photoexcitation, le transfert d'électrons à l'état excité réduit les hèmes dans les nanofils et donc la photoréduction contribue à la photoconductivité des nanofils.

Pour comprendre l'origine des différents états d'oxydation transitoires, nous avons déterminé la cinétique aux longueurs d'onde clés mentionnées ci-dessus à l'aide d'un modèle séquentiel44 qui a donné la première échelle de temps d'excitation de 19 ± 23 fs (voir méthodes). Cette échelle de temps est plus rapide que la fonction de réponse de l'instrument (100 ± 50 fs) et peut donc être traitée comme une excitation instantanée sur l'échelle de temps de la mesure (Fig. 4a). Suite à cette excitation, les charges ont été transférées entre hèmes avec un temps de décroissance de 212 ± 27 fs. Les spectres correspondants sont une superposition d'un agent de blanchiment à l'état fondamental et l'apparition d'une nouvelle caractéristique autour de 367 nm, qui peut être attribuée aux hèmes doublement oxydés selon les simulations spectrales (Fig. 3d). Sur la base de simulations (voir ci-dessous, Fig. 4d), nous concluons que le transfert de charge ultrarapide entraîne également la formation d'un hème réduit dans son état excité, qui est spectroscopiquement sombre. Nous avons également trouvé une deuxième décroissance avec une constante de temps de 1, 0 ± 0, 1 ps qui peut être attribuée à la relaxation de l'hème réduit excité qui augmente en absorption au Soret réduit à λ = 424 nm. De plus, nous avons trouvé un troisième temps de décroissance de 7,9 ± 0,3 ps qui peut être attribué à la recombinaison à leur état initial, y compris les transferts de charge vers les états fondamentaux de l'hème oxydé individuellement.

un diagramme de niveau d'énergie simplifié pour les hèmes illustrant les changements qui se produisent lors de la photoexcitation dans l'absorption transitoire et leurs temps de décroissance respectifs. b Le courant d'obscurité dans l'état fondamental est dû à la propagation d'un état réduit créé par l'injection d'électrons depuis l'électrode. c Le photocourant est dû à l'excitation laser initiant un transfert de charge ultrarapide entre les hèmes, créant des hèmes nouvellement réduits (rouge) et doublement oxydés (bleu). La photoréduction fournit des porteurs de charge supplémentaires et une plus grande force motrice pour le transfert de charge, ce qui augmente donc le courant sous polarisation. d Simulations de dynamique quantique du transfert de charge ultrarapide entre hèmes dans des nanofils de protéines, formant un hème doublement oxydé et un état excité d'un hème réduit.

Nous avons en outre comparé nos spectres UV-Vis expérimentaux de nanofils avec les calculs de la théorie fonctionnelle de la densité en fonction du temps des hèmes dans le nanofil (Fig. 3d). Le maximum de la bande de Soret calculée dans l'hème réduit (λ = 420 nm) est décalé de 9, 5 nm vers le rouge du maximum de la bande pour l'hème oxydé, en bon accord avec le décalage de 10, 5 nm observé expérimentalement (Fig. 3d). Ces analyses informatiques suggèrent en outre que la photoexcitation provoque une réduction des hèmes dans les nanofils. Notre découverte est cohérente avec des études antérieures sur la photoréduction des cytochromes monomères médiée par l'état excité induit par la lumière des hèmes, même en l'absence de donneurs d'électrons externes45,46.

Pour évaluer les données de cinétique transitoire obtenues à l'aide du modèle séquentiel ajusté aux données expérimentales, nous avons effectué des simulations de dynamique quantique au niveau de la théorie étendue de Hückel47,48. Nous avons simulé la propagation d'un paquet d'ondes d'électrons à l'état excité à partir d'hèmes dans les nanofils, aussi bien en mode slip-stack qu'en mode T-stack7. Nos simulations suggèrent une échelle de temps d'environ 100 fs pour le transfert de charge photo-induit entre la paire d'hèmes superposés (Fig. 4d). Cette échelle de temps est en accord avec l'échelle de temps déterminée expérimentalement pour le transfert de charge à l'état excité (212 ± 27 fs). La probabilité de survie pour le transfert d'électrons dans une paire d'hèmes à pile glissée reste faible (<60%) pour la plupart des niveaux d'énergie, indiquant une forte probabilité de transfert d'électrons vers un hème proche dans les 100 fs (Fig. 9 supplémentaire). Ainsi, l'échelle de temps pour le transfert d'électrons entre les paires d'hèmes à empilement glissé reste similaire pour la plupart des niveaux d'énergie.

Comme aucun donneur d'électrons externe n'a été ajouté, nos résultats suggèrent que les électrons supplémentaires qui réduisent l'hème sont intrinsèques au nanofil lui-même. Nous avons en outre analysé la possibilité que la protéine environnante provoque la photoréduction observée des hèmes OmcS. Plusieurs acides aminés aromatiques, dont le tryptophane et la tyrosine, se situent à moins de 5 Å des hèmes dans l'OmcS. Bien que l'excitation du tryptophane ou de la tyrosine ne soit pas possible aux longueurs d'onde utilisées dans cette étude45,46, nous avons envisagé la possibilité que le transfert d'électrons puisse éteindre un hème photoexcité d'une manière similaire aux flavines dans un cryptochrome49. Cette trempe réduirait un hème et laisserait un radical d'acide aminé. L'acide aminé candidat le plus probable pour la formation de radicaux est le tryptophane car ses radicaux ont une absorbance qui expliquerait l'espèce à 367 nm50. Bien que la formation de tels radicaux soit possible, la force du signal dans les mesures de fs-TA est déterminée par les coefficients d'extinction molaire (ε) de l'espèce (transitoire). Le coefficient d'extinction molaire de la bande de Soret pour l'OmcS est environ 100 fois supérieur à celui des radicaux tryptophane50,51. L'eau de Javel à l'état fondamental représente tous les hèmes photoexcités dans les nanofils OmcS et les espèces correspondant à λ = 367 nm et 424 nm ont des absorptions différentielles d'environ 20 et 10% de la magnitude totale, respectivement (Fig. 3e). Par conséquent, le nombre de radicaux tryptophane créés à partir du transfert d'électrons doit être supérieur au nombre d'hèmes excités dans OmcS si l'espèce radicale à λ = 367 nm provient du tryptophane. Une telle possibilité semble peu probable car un seul radical peut être créé pour chaque hème excité éteint. Ainsi, les spectres observés ne peuvent pas être expliqués par des radicaux d'acides aminés.

Nous avons également évalué les possibilités d'autres sources d'électrons provoquant une photoréduction. Nous avons constaté que les processus multiphotons sont absents de nos expériences car la dynamique ET était indépendante de l'intensité et de la puissance du laser (Fig. 8 supplémentaire). L'amplitude du photocourant est également linéaire avec une puissance accrue (Fig. 3 supplémentaire).

Les impuretés redox n'ont pas non plus contribué aux spectres mesurés en raison d'une dynamique identique en solution et à l'état solide (Fig. 7 supplémentaire). La photodégradation n'a pas non plus modifié la dynamique de transfert d'électrons, seulement l'amplitude des spectres de <10% sur deux heures.

Nous avons donc envisagé une possibilité alternative selon laquelle les hèmes empilés en parallèle peuvent servir de paire donneur et accepteur d'électrons (Fig. 4). Nous avons émis l'hypothèse que le transfert de charge à l'état excité se produit entre deux hèmes voisins, un seul des hèmes étant à l'état excité. Un tel transfert de charge entraînerait l'apparition d'un hème réduit et laisserait un hème doublement oxydé (Fig. 4). Le spectre UV-Vis calculé d'un hème doublement oxydé a en effet montré un maximum d'absorption à λ = 365 nm qui est en accord avec les espèces observées expérimentalement à λ = 367 nm. Notre spectre calculé d'un hème doublement oxydé recrée ainsi le décalage vers le bleu observé dans l'expérience d'absorption transitoire (Fig. 10 supplémentaire). L'accord qualitatif entre les spectres calculés et expérimentaux est indépendant de l'état de spin des espèces doublement oxydées telles que l'état singulet et triplet.

Pour identifier la nature des espèces doublement oxydées, nous avons effectué une analyse des populations de spin atomique. Nous avons constaté que le changement dans les populations de spin se produit uniquement sur les ligands et non sur le centre de fer. Par conséquent, notre analyse suggère que les espèces doublement oxydées sont Fe3+ + radical porphyrine, ce qui est en accord avec les spectres observés à 367 nm. Ces analyses suggèrent en outre que les espèces doublement oxydées ne sont pas Fe4 + en raison de l'absence de changement de densité de spin sur le centre de fer lors d'une oxydation supplémentaire de l'hème à l'état Fe3 + (Fig. 10 supplémentaire et Tableau supplémentaire 1).

Pour évaluer davantage la faisabilité thermodynamique des espèces d'hème radical, nous avons utilisé le cycle de Rehm-Weller. Cette analyse nécessite quatre termes énergétiques : (1) l'énergie nécessaire pour former des espèces d'hème radical (basées sur les systèmes fer-porphyrine52) (1,7 V), (2) le potentiel redox à l'état fondamental d'OmcS (−212 mV)51, (3) l'énergie photonique utilisée pour exciter les nanofils OmcS (λ = 545 nm = 2,3 eV), et (4) la différence d'énergie vibrationnelle entre les états fondamental et excité, appelée énergie de stabilisation de Coulomb associée à la paire d'ions radicaux intermédiaires53 (ωp) ~60 moiV. Par conséquent, l'énergétique de ce processus serait ΔGet = [1,7 eV–(−0,212 eV) + 0,06 eV] −2,3 eV = −0,4 eV. Ainsi, ΔGet < 0 pour la formation des espèces d'hème radical, ce qui les rend énergétiquement faisables. Notre analyse est une estimation inférieure de l'énergie nette disponible pour la formation des espèces radicalaires. Par conséquent, en combinaison avec notre analyse simulée, nos études suggèrent que les espèces doublement oxydées sont des radicaux porphyrine Fe3 + + et que les nanofils sont photoréduits par un transfert de charge hème à hème induit par la lumière ultrarapide.

Sur la base des résultats ci-dessus, nous proposons le modèle suivant pour l'origine de la photoconductivité dans les nanofils OmcS (Fig. 4). Ce modèle se concentre sur les états singulets et non sur les états triplets car ces états sont spectroscopiquement sombres et seraient moins prononcés en raison de leurs énergies plus faibles. Comme ces nanofils transportent des charges à travers un empilement homogène d'hèmes (Fig. 1c), nos expériences antérieures ont montré qu'ils peuvent être traités comme des conducteurs redox, le transfert de charge à longue portée étant régi par un mécanisme de saut théoriquement prédit avec une perte de porteuse négligeable sur micromètres54. Tous les hèmes des nanofils sont initialement oxydés et dans leur état fondamental, comme le confirme la spectroscopie UV-Vis (Fig. 2b). Lors de l'application d'une polarisation, des électrons sont injectés de l'électrode dans le nanofil, créant un état réduit qui traverse le nanofil (Fig. 4b). La photoexcitation déclenche un transfert de charge ultrarapide entraînant un état réduit supplémentaire qui persiste pendant une échelle de temps picoseconde, sans aucune polarisation appliquée, loin de l'électrode (Fig. 4c). Cet état réduit nouvellement formé aura une mobilité similaire à l'état injecté par électrode car ils sont tous deux présents dans le même nanofil avec une structure identique. Par conséquent, lors de la photoexcitation, la densité d'états réduits est augmentée, augmentant ainsi la densité de porteurs de l'OmcS pour générer de la photoconductivité dans les nanofils. La photoréduction observée dans notre fs-TA est cohérente avec ce modèle.

En plus de la densité de porteurs plus élevée due aux électrons photogénérés, il est probable que la mobilité des électrons augmente lors de la photoexcitation en raison de la force motrice accrue pour le transfert de charge dans l'état excité des hèmes43. Lors de la photoexcitation, un électron passe de l'état fondamental à un état excité. Le transfert de charge ultrarapide entre hèmes voisins crée un hème à l'état réduit à l'état excité et un hème doublement oxydé (Fig. 4c, d). L'hème à l'état réduit peut alors se détendre de l'état excité à l'état fondamental. Lors de la photoexcitation, le nanofil uniformément oxydé est ainsi partiellement réduit et partiellement doublement oxydé (Fig. 4c).

L'hème doublement oxydé généré modifiera les énergies redox de la chaîne hémique, avec un potentiel redox plus positif. Nous avons précédemment découvert que le potentiel redox des hèmes OmcS devient sensiblement positif lors de l'oxydation43. Les nanofils OmcS transportent des charges via un mécanisme de saut54, un processus dans lequel une charge (électron ou trou) réside temporairement dans un hème, modifiant son état redox. La force motrice du transfert de charge dépend des énergies redox des hèmes donneurs et accepteurs d'électrons. Par conséquent, le taux de transfert de charge est directement lié à la mobilité.

Pour l'état entièrement oxydé (non excité), ce processus s'initie à la surface de l'électrode où les électrons injectés sautent vers des sites redox de nanofils, créant des hèmes localement réduits. Pour l'état photoexcité, ce processus est amélioré car le transfert d'un électron vers l'espèce doublement oxydée et l'élimination d'un électron d'un hème réduit sont nettement plus favorables dans le nanofil éclairé que pour le nanofil oxydé dans l'obscurité. La probabilité accrue de transfert de charge lors de la photoexcitation se traduira alors par une mobilité accrue. De plus, le transfert de charge ultrarapide initial entre les hèmes augmente la durée de vie de l'état photogénéré. La génération d'une "nouvelle" charge mobile et l'augmentation de sa mobilité contribueront à l'augmentation observée de la conductivité lors de la photoexcitation.

En résumé, nous démontrons, pour la première fois, une photoconductivité significative dans un système vivant en raison du transfert de charge ultrarapide induit par la lumière dans les nanofils de protéines. L'origine surprenante de la photoconductivité dans ces systèmes naturels réside dans la densité et la mobilité des porteurs plus élevées lors de la photoexcitation.

Bien que le transfert d'électrons ultrarapide puisse se produire dans les cytochromes monomères, il nécessite généralement des colorants incorporés comme photosensibilisateurs et donneurs d'électrons sacrificiels36 qui peuvent être toxiques pour les cellules1. En revanche, nous constatons que les nanofils protéiques présentent intrinsèquement un transfert de charge robuste et ultrarapide sans aucun besoin d'un tel marquage sélectif de site. Nos études établissent ainsi les nanofils OmcS comme des photoconducteurs intrinsèques aux cellules avec une capacité de transfert d'électrons ultrarapide, éliminant ainsi le besoin de matériaux étrangers tels que des colorants moléculaires ou des nanoparticules inorganiques qui limitent les performances catalytiques1.

De plus, nos études montrent que le transfert de charge sub-ps est possible dans les protéines naturelles à l'état excité. Des études antérieures de transfert d'électrons ultrarapides ont rapporté des taux d'état fondamental de 15 à 90 ps dans les hèmes empilés les plus proches36. Cette différence est probablement due au fait que les taux d'état excité sont connus pour être plus rapides en raison d'une énergie plus élevée et d'une plus grande délocalisation orbitale par rapport aux taux d'état fondamental49.

Bien que de nombreuses études EET bactériennes restent focalisées sur les électrons, les protons jouent un rôle très important, non seulement dans la génération d'énergie bactérienne, mais aussi dans la conductivité électronique des protéines55. Par exemple, grâce à des mesures du taux de transfert d'électrons intrinsèque, nous avons précédemment constaté que l'énergétique d'une glutamine (accepteur de protons) et sa proximité avec une tyrosine voisine (donneur de protons) régulent le transport des trous sur des micromètres dans les amyloïdes à travers un basculement de protons. mécanisme56. Par conséquent, il est très important de coupler le transfert électron/proton pour accélérer l'EET et pour le développement de biomatériaux à base de protéines conductrices électroniques.

La surface élevée de ces nanofils, combinée à leur biocompatibilité et à leur absence de toxicité, en font des candidats attrayants pour un domaine émergent de la bioélectrocatalyse de cellules entières axée sur la lumière pour un large éventail d'applications telles que la séparation de l'eau, la détection chimique et la fixation du CO2 et production de produits chimiques, de carburants et de matériaux57. Nos études peuvent également aider à établir la production efficace et stable de combustibles liquides à partir de la lumière solaire en utilisant une approche de lumière solaire liquide5. De futures études sur les nanofils avec différents empilements d'hème et environnement protéique8 ou en remplaçant les métaux du fer par du zinc58 ou de l'étain59 pourraient faire varier les interactions entre les cofacteurs de l'hème pour modifier les propriétés électroniques et photophysiques des nanofils pour une fonctionnalité accordable57.

La souche CL-1 de Geobacter sulfurreducens60, qui produit une abondance élevée de protéine OmcS37, a été obtenue à partir de notre collection de cultures de laboratoire et cultivée sur des électrodes dans un système bioélectrochimique comme décrit précédemment20,61. Pour la croissance en culture liquide, les cellules ont été cultivées jusqu'à la phase stationnaire61 et collectées par centrifugation, puis une version légèrement modifiée d'un protocole précédemment décrit7 a été utilisée pour cisailler les filaments extracellulaires des cellules. En bref, les cellules culottées ont été mises en suspension dans 150 mM d'éthanolamine pH 10,5 et mélangées pendant 2 min à basse vitesse dans une unité commerciale (Waring). Les cellules et les débris cellulaires ont été éliminés par centrifugation, d'abord à 13 000 puis à 23 000 x g. Les filaments d'OmcS ont ensuite été collectés soit par précipitation dans du sulfate d'ammonium à 12,5 %, soit par ultracentrifugation à 100 000 xg, conformément aux protocoles précédemment décrits pour l'obtention de nanofils microbiens à partir de G. sulfurreducens10. Les échantillons de filaments OmcS collectés ont été remis en suspension et stockés dans 150 mM d'éthanolamine pH 10,5 et dialysés pour éliminer le sulfate d'ammonium résiduel, le cas échéant.

Les spectres UV-Vis ont été enregistrés avec un spectrophotomètre (Avantes AvaSpec-ULS2048CL-EVO). Pour les nanofils, une lame de quartz a été nettoyée avec de l'éthanol et 2 µl de protéine 80 µM ont été déposés sur cette lame puis séchés pendant 20 min dans le dessiccateur. 2 ul supplémentaires ont été déposés au même endroit et à nouveau séchés dans le dessiccateur pendant 20 minutes. Le spectre a été recueilli pour l'échantillon oxydé à l'air. Ensuite, 40 mg / ml de dithionite de sodium dans de l'eau ont été déposés pour couvrir la tache de protéine (2 à 3 µl). Le dithionite a provoqué une réduction chimique des hèmes dans la protéine. Le spectre du matériau réduit a ensuite été enregistré. Tous les spectres ont été normalisés de sorte que les valeurs d'absorbance minimale et maximale pour les longueurs d'onde supérieures à 380 nm ont été fixées à zéro et 1, respectivement. Les mesures à l'état solide du biofilm ont été prises sur une électrode FTO dans des conditions d'hydratation avec le fond d'une électrode FTO propre soustraite.

Trois types d'électrodes différents, à base d'or (Au), de tungstène (W) et d'oxyde d'étain dopé au fluor (FTO), ont été utilisés. Les conceptions se composaient d'électrodes interdigitées, qui créent un motif de «doigt» dans lequel chaque ligne impaire est connectée à un plot, et chaque ligne paire au contact électrique opposé. Ce garnissage dense des électrodes assure un grand nombre de contacts électroniques. Les données mesurées sont en moyenne sur 132 paires de connexions de fils et fournissent un signal supérieur par rapport à un appareil à électrode unique.

Pour les électrodes en or, l'espacement entre chaque ligne était de 5 µm, et pour les électrodes en tungstène et FTO, l'espacement était de 10 µm. Dans tous les cas, l'électrode (la partie métallisée) avait une largeur de 10 µm.

Les électrodes d'or et de tungstène ont été fabriquées par lithographie UV sur une plaquette de silicium oxydée thermiquement. L'oxydation thermique a créé une couche d'oxyde de silicium de 300 nm qui fournit un substrat uni et électriquement isolant. Les électrodes métalliques ont été fabriquées par revêtement par centrifugation d'un double résist, composé de LOR 5-A et S1805. LOR 5-A a été enduit à 3000 tr/min pendant 1 min suivi de 5 min de chauffage à 180 °C. Après cette étape de cuisson, une deuxième couche de réserve S1805 a été appliquée à 3000 tr/min pendant 1 min et durcie à 120 °C pendant 2 min. Ensuite, les résines ont été exposées à un rayonnement UV à travers un masque d'ombre et développées dans un révélateur MIF 319 pendant 2 minutes. Les photorésists structurés ont ensuite été métallisés à l'aide de 5 nm de Ti ou de Cr et de 40 à 60 nm d'Au ou de W. Un décollage dans de la NMP chauffée (80 à 120 ° C) a éliminé les résists métallisés et a abouti à l'électrode de microstructure finale. Un revêtement de protection a ensuite été appliqué par centrifugation sur le dispositif. Ce revêtement a été lavé avec de l'acétone avant d'utiliser l'électrode. Chaque électrode a été testée avant le dépôt de protéines pour assurer une bonne isolation électrique entre les deux électrodes.

Pour les électrodes FTO IDE, du FTO disponible dans le commerce sur du verre de quartz a été utilisé. La réserve S1805 a été enduite par centrifugation et structurée comme décrit précédemment. Après structuration, cette réserve a été utilisée comme masque souple dans la gravure ionique réactive. La gravure a été réalisée dans un Oxford Plasmalab 100 RIE avec une pression de chambre de 8 mTorr et un flux de gaz de 8 sccm Cl2 et 40 sccm Ar. La gravure a été effectuée jusqu'à ce que le FTO indésirable soit complètement éliminé. Le photorésist restant a été nettoyé dans du NMP chaud (120 ° C) et les dispositifs finaux ont été recouverts d'un revêtement protecteur. Ce revêtement a été enlevé avec de l'acétone avant l'utilisation des électrodes. Chaque électrode a été soigneusement vérifiée pour s'assurer que les deux contacts sont électriquement isolés.

Les mesures de conductivité sur les nanofils et les biofilms ont été effectuées comme décrit précédemment62. Les connexions aux électrodes de l'appareil ont été réalisées avec une station de sonde (MPI TS50) à l'intérieur d'une boîte noire qui formait une cage de Faraday et bloquait également la lumière de fond. Le courant et la tension ont été appliqués à l'aide d'un analyseur de paramètres à semi-conducteurs avec des préamplificateurs (Keithley 4200 A-SCS) permettant une résolution de courant de 1 fA et de tension de 0,5 μV. Les mesures de conductance CC à deux points ont utilisé deux aiguilles de sonde pour entrer en contact avec le dispositif sur deux électrodes adjacentes. Une tension fixe dans la plage de ± 0,3 V a été appliquée aux deux électrodes pendant un minimum de 100 s en mode échantillonnage jusqu'à ce qu'un courant stable soit atteint. Les points tension-courant ont été ajustés avec une ligne et la pente a été utilisée pour déterminer la conductance (G).

Les dispositifs ont été préparés en laissant tomber 0,5 µL de nanofils de 8 µM dans 150 mM d'éthanolamine pH 10,5 sur le dispositif et en laissant sécher dans l'atmosphère ambiante pendant une nuit. La goutte formée sur le matériau avait un diamètre de 1,4 ± 0,1 mm. La surface de l'électrode était de 2 × 2 mm, ce qui garantissait que tout le matériau était en contact électrique.

Pour effectuer des mesures de photoconductivité, la station de sonde décrite précédemment était équipée d'un laser à diode, avec un flux de sortie moyen de 100 mW/cm2 et une longueur d'onde centrale de 408 nm. Cette tache laser a été ajustée pour être plus grande que la surface de l'électrode ce qui a assuré une excitation homogène du matériau. Le faisceau laser a été bloqué/libéré à l'aide d'un obturateur optique avec un temps de réponse de 1 ms.

Des mesures de conductance sur des nanofils réduits ont été effectuées en mélangeant 0,25 µL d'une solution concentrée de dithionite de sodium avec 9,75 µL de nanofils dans un environnement anaérobie de sorte qu'il y avait un excès molaire de 50 fois de dithionite à la concentration d'hème dans la solution finale. 0,5 µL a été déposé sur une électrode et séché dans la chambre anaérobie pendant une nuit.

Les spectres d'absorption transitoire ont été recueillis au Centre des nanomatériaux fonctionnels (CFN), qui fait partie du Laboratoire national de Brookhaven. D'autres données ont été recueillies à l'Université Drexel. Le rapport signal sur bruit du spectromètre CFN commercial était supérieur aux données de Drexel, par conséquent, les données recueillies à Drexel ont été uniquement utilisées dans le supplément de ce manuscrit. La description détaillée fait référence à la collecte de données au CFN.

Les spectres TA ont été collectés à l'aide d'un spectromètre Helios (Ultrafast Systems) TA. La longueur d'onde d'excitation a été générée dans un TOPAS OPA. L'impulsion de la sonde a été générée via un supercontinuum dans du fluorure de calcium.

Pour chaque mesure, le chevauchement spatial a été optimisé pour le signal le plus fort. Chaque ensemble de données a été itéré pendant plusieurs heures. Chaque itération a ensuite été comparée à la moyenne de l'itération pour assurer la stabilité à long terme du spectromètre et du matériau de l'échantillon.

L'échantillon a été préparé en coulant goutte à goutte 5 µl de solution protéique sur un substrat de quartz fraîchement nettoyé. Les échantillons ont été laissés sécher pendant 60 minutes dans un dessiccateur. Ce dépôt a été répété pour créer des films plus épais. Sur la base de la transmission optique, un emplacement sur l'échantillon avec une absorption de bande de Soret suffisante et une diffusion acceptable a été choisi.

Les spectres TA collectés ont été traités à l'aide de trois logiciels : Surface Xplorer (Ultrafast Systems), MATLAB et Glotaran. Surface Xplorer a été utilisé pour visualiser les données et sélectionner des mesures avec un rapport signal/bruit adéquat. Cette sélection a réduit le nombre de spectres traités à 15. Parmi ces mesures, sept ont été pompées à 545 nm (indiquées dans le texte principal), quatre pompées à 530 nm (indiquées en SI) et quatre pompées à 400 nm (indiquées en SI). Toutes ces mesures ont été évaluées pour déterminer la cinétique et la dynamique de l'évolution spectrale. L'évaluation principale a été effectuée pour une longueur d'onde de pompe de 545 nm, car cela déposait l'énergie la plus faible et donc chauffait dans le matériau de l'échantillon. Les deux autres longueurs d'onde ont confirmé la cinétique déterminée.

Surface Xplorer a été utilisé pour compenser le chirp spectral associé à la dispersion dépendante de la longueur d'onde dans l'échantillon utilisé et le substrat de quartz. Cette correction garantissait que le point zéro du temps était indépendant de la longueur d'onde. Après ce traitement initial, les 1024 points de longueur d'onde mesurés ont été moyennés adjacents à 512 points, ce qui a donné une résolution de longueur d'onde d'environ 1 nm.

Les données prétraitées ont ensuite été importées dans MATLAB. Six mesures à une pompe à 545 nm ont été moyennées en un seul ensemble (après avoir pris en compte la gigue de temps zéro). Ces ensembles de données sont présentés dans le texte principal. La dynamique à 410 nm, 367 nm et 424 nm a été simultanément équipée d'une double fonction exponentielle convoluée avec la fonction de réponse de l'instrument et un modèle d'injection instantanée comme fonction Heaviside. Les durées de vie de cet ajustement dynamique simple à trois longueurs d'onde sont utilisées comme points de départ pour l'analyse détaillée de la cible à l'aide de Glotaran.

Les données prétraitées (provenant du traitement des données Surface Xplorer) ont ensuite été chargées dans Glotaran et tronquées à -2 ps à l'infini dans le temps et à 340-505 nm dans l'espace des longueurs d'onde. Ce logiciel a été utilisé pour l'analyse globale. Le modèle suppose une dynamique de décroissance globale définie par un nombre fixe de constantes de décroissance. Sur la base de notre modèle, nous avons décidé qu'une analyse séquentielle est la mieux adaptée pour décrire les processus dans l'OmcS photoexcité.

Le modèle séquentiel, cependant, ne peut pas séparer directement les espèces individuelles de l'eau de Javel à l'état fondamental des espèces principales. Ceci est causé par le chevauchement temporel entre les désintégrations et la désintégration parallèle dans l'état fondamental de l'espèce d'hème excitée qui ne subit pas complètement une étape de séparation de charge.

Le modèle séquentiel suppose une excitation ajustée à 19 ± 23 fs. C'est plus rapide que l'instrument répond fonction de 100 ± 10 fs. L'excitation peut donc être considérée comme instantanée (justifiant l'approximation de Heaviside utilisée dans l'analyse préliminaire sous MATLAB). Suite à l'excitation, les charges sont transférées d'un hème à l'autre en 212 ± 27 fs. Les spectres correspondants sont une superposition d'une eau de Javel à l'état fondamental et l'apparition d'une nouvelle caractéristique autour de 367 nm, qui est identifiée comme un double hème oxydé (selon la simulation spectrale présentée). Ce transfert de charge se traduit par la formation d'un hème réduit à l'état excité. Une seconde décroissance avec une constante de temps de 1 ± 0,1 ps décrit la relaxation de l'hème réduit excité. Une troisième constante de temps finale avec 7,9 ± 0,3 ps décrit la relaxation du système à son état initial, y compris le transfert de charge vers l'état fondamental de l'hème oxydé unique.

La topographie et la conductivité électrique des nanofils à la surface de l'or ont été mesurées à l'aide des modes de mesure conventionnels par tapotement (AC) et par microscopie conductrice à force atomique (c-AFM, ORCA™) avec un AFM disponible dans le commerce (Cypher ES, Oxford Instruments Asylum Research, USA) équipé de l'excitation photothermique blueDrive™. La sonde était une sonde ASYELEC-01-R2 disponible dans le commerce (Asylum Research) avec un revêtement Ti/Ir et une fréquence de résonance nominale f = 75 kHz, une constante de ressort k = 2,8 N/m et un rayon de pointe Rtip = 28 ± 10 nm ; les valeurs mesurées étaient f0 = 86,6 kHz et k0 = 5,8 N/m pour la sonde spécifique utilisée dans ces mesures. Afin de biaiser l'échantillon, un petit aimant en néodyme (1/32" x 1/16" diam., K&J Magnetics) a été à la fois collé et mis en contact électrique avec la surface supérieure de l'échantillon de nanofils sur or à l'aide de peinture à l'argent (PELCO ® Leitsilber, Ted Pella).

Pour la topographie en mode tapotement, la sonde a été pilotée avec un actionnement piézo à une vitesse de balayage de 1 ligne/s, une amplitude libre de 120 nm (0,58 V à une sensibilité de 207 nm/V) et un point de consigne d'environ 100 nm (0,5 V ) pour maintenir l'interaction pointe-échantillon très douce dans l'état dit "attractif" ou "sans contact" pour éviter d'endommager les nanofils.

Après le balayage topographique, cAFM a été utilisé avec un point de consigne de force de 50 nN pour exécuter des mesures du point IV sur des nanofils individuels afin de mesurer leur conductivité (n = 15 nanofils), avec un balayage de tension d'échantillon de ± 0,5 V à une vitesse de balayage de 1 V/s pour 20 cycles de balayage à une fréquence d'acquisition de 2 kHz (filtre passe-bas de 1 kHz). Les effets supplémentaires de la photoexcitation sur la conductivité des nanofils ont été examinés en basculant le laser blueDrive™ comme source d'excitation (405 nm, 10 mW DC, avec un diamètre de spot de 2 ± 1 µm) sur au moins 20 balayages IV séquentiels. Cela a été accompli en utilisant le cube de filtre 0,01X fourni (Asylum Research) et en positionnant le point laser au sommet même de la pointe de la sonde (plutôt que de l'utiliser comme excitation oscillatoire de la sonde) ; cela fournit [10e-3 W]/[π*(1e-6 m)2]*0,01 = 32 µW/µm2 d'éclairage sur les nanofils.

Pour les expériences de contrôle dans ces mesures pc-AFM, un échantillon d'or dépouillé de modèle frais (identique à la surface sur laquelle les nanofils ont été déposés) a également été préparé avec un contact électrique comme ci-dessus. En tant que contrôle positif, la conductivité pointe-or a été mesurée dans les mêmes conditions (force de charge de 50 nN, ± 0,5 V à 1 V/s, 20 cycles) pour assurer un contact ohmique en l'absence de nanofils. En tant que contrôle négatif pour les mesures photoconductrices, la conductivité pointe-or a été mesurée dans les mêmes conditions (force de charge de 50 nN, ± 0,5 V à 1 V/s, 20 cycles) avec l'excitation blueDrive activée et désactivée séquentiellement pour confirmer qu'il y a n'y avait aucun changement dans la conductivité pointe-or à partir de l'excitation à 405 nm en l'absence de nanofils.

À chaque point de collecte sur un nanofil individuel, au moins 20 courbes IV ont été collectées. La dernière moitié de toutes les courbes de tension de courant collectées (minimum 10 courbes) en un seul point a été utilisée pour calculer la conductance. Les courbes IV ont ensuite été triées par nanofil et la pente de chaque courbe a été mesurée pour obtenir la conductance. Pour tous les nanofils, toutes les valeurs aberrantes de la conductance ont été supprimées par une analyse de l'écart médian de trois absolutions sur le log10 de la conductance. Toutes les valeurs de conductance individuelles restantes pour chaque nanofil ont été moyennées pour obtenir la conductance moyenne du nanofil unique. L'analyse des courbes de tension de courant laser OFF et laser ON était identique.

Lors de l'interprétation des expériences de photoexcitation, il est crucial de vérifier si l'expérience a été réalisée dans un régime d'excitation linéaire ou non linéaire. Dans ce dernier cas, la photoexcitation serait suffisamment forte pour déclencher des effets non linéaires (c'est-à-dire une absorption saturable) ou provoquer une interaction électron-électron (ee diffusion, effet Auger, etc.). Ces effets rendraient une discussion concluante des expériences plus difficile. Dans le régime linéaire, seul un faible pourcentage de molécules est excité, tandis que la majorité reste dans son état fondamental. Bien qu'il n'y ait pas de seuil ultime pour le régime linéaire ou non linéaire, il est courant d'accepter moins de 1 % d'excitation comme linéaire.

Nous avons calculé les excitations en pourcentage sur la base de la densité de puissance optique connue de 100 mW/cm2 et de la durée de vie totale du système photoexcité (τ = 7,9 ps). Le concept de base utilisé ici est qu'à un moment donné, un certain nombre de photons frappent les hèmes et les excitent tandis que les hèmes précédemment excités se recombinent dans leur état fondamental.

La recombinaison est décrite comme N(t) = N(t-Δt) e^-Δt/τ, avec Δt comme petit pas de temps63. L'excitation laser CW a été discrétisée en utilisant le pas de temps pour produire un flux total de photons défini par la puissance laser. En supposant un rendement quantique de 100 %, cela signifie que la génération d'hèmes excités est décrite directement par le flux de photons. A partir de t = 0, la population croît en compétition avec la recombinaison comme N(t) = G(Δt) -N(t-Δt) e^-Δt/τ. Après un temps d'une nanoseconde, N(t) s'approche d'une valeur quasi stationnaire de 1,6 106 molécules/cm2. En comparant cette valeur à la densité protéique totale de 2,5 1013 molécules/cm2, on obtient un rapport de 6,4 10−6 %. Cette valeur approchée est bien inférieure à 1%, justifiant l'interprétation linéaire de nos expériences.

Les cofacteurs hémiques de type c d'OmcS ont été modélisés sous forme de porphyrine de fer, les substituants méthyle, thioéther et acide propionique du macrocycle étant remplacés par des atomes d'hydrogène. Les deux résidus d'histidine coordonnés axialement ont été tronqués au niveau de la liaison Cb – Cg pour donner des ligands 1-méthylimidazole. Ce système modèle a été largement utilisé pour caractériser théoriquement les structures, les spectres et la réactivité des cofacteurs de l'hème64.

La géométrie du modèle de l'hème a été optimisée au niveau de la théorie fonctionnelle de la densité (DFT) dans les états redox réduits, oxydés individuellement et doublement oxydés. Les analyses de fréquence harmonique ont confirmé que le modèle d'hème était à un minimum local sur la surface d'énergie potentielle de l'état fondamental respectif pour chaque état redox. Les espèces réduites et oxydées individuellement ont été optimisées avec la multiplicité de spin la plus faible (singulet et doublet, respectivement). Le modèle d'hème doublement oxydé a été examiné à la fois dans les variétés triplet et singulet. Pour les espèces à l'état fondamental à oxydation simple et double, la valeur attendue de l'opérateur de spin au carré, , était de 0,75 et de 2,00 après annulation des contaminants de spin.

Toutes les optimisations géométriques et les analyses de fréquence harmonique ont été effectuées avec la fonctionnelle hybride de Becke, à trois paramètres, Lee-Yang-Parr (B3LYP)65 et un ensemble de bases mixtes, en appliquant les fonctions de noyau et de cantonnière efficaces LANL2DZ à Fe66, et le 6-31 G (d) base aux atomes H, C et N. Comme pour les calculs d'excitation verticale décrits dans la sous-section suivante, nous avons utilisé une convergence de champ auto-cohérente serrée et une grille d'intégration ultrafine, comme mis en œuvre dans Gaussian 16 révision A.03.

La simulation a été réalisée sur deux types de paires d'hèmes adjacentes, à savoir le T-Stack et le slip stack présents dans la structure OmcS (Fig. 1d). Seules les paires slip-stack présentaient un transfert de charge (Fig. 9b supplémentaire). Par conséquent, ce calcul était limité aux hèmes voisins.

Le spectre d'absorption de l'hème dans chaque état redox a été simulé sous vide avec une DFT dépendante du temps (TD) en utilisant la fonction B3LYP et un ensemble de base 6-31 + G(d) pour tous les atomes67,68,69. Les spectres prédits étaient uniformément décalé de 38 nm pour améliorer l'alignement avec les spectres expérimentaux. Les états excités d'intérêt - les deux transitions de Soret - présentaient une certaine contamination de spin pour les espèces à simple et double oxydation, ce qui est un problème bien connu avec TD-DFT70. Cependant, ne déviait que de 0,2 à 0,5 de la valeur non contaminée, et le décalage vers le bleu prévu pour les espèces doublement oxydées par rapport aux espèces réduites ou oxydées une seule fois était similaire, qu'il ait été modélisé comme un singulet à coque fermée ou triplet à coque ouverte. Nous concluons donc que le décalage vers le bleu nécessaire pour expliquer l'observation expérimentale est indépendant de la contamination de spin présente dans nos calculs en coque ouverte.

La dynamique du transfert d'électrons intermoléculaire photoinduit entre les hèmes adjacents a été modélisée avec une méthodologie de propagation de paquets d'ondes décrite précédemment mise en œuvre dans le cadre étendu de Hückel à liaison étroite47. Ce niveau de théorie était auparavant utilisé pour décrire la structure électronique du fer, ainsi que d'autres métalloporphyrines48.

Les structures utilisées à la fois pour les simulations de spectres optiques et les simulations de dynamique quantique sont fournies en tant que données supplémentaires 1.

La taille des échantillons était basée sur les conventions acceptées dans le domaine pour assurer la reproductibilité et les statistiques et aucune analyse de puissance explicite n'a été effectuée. Aucune donnée n'a été exclue de l'analyse. Toutes les expériences ont été répétées indépendamment plusieurs fois définies dans la légende et toutes les tentatives pour reproduire les expériences ont réussi. La randomisation n'était pas pertinente pour l'étude car tous les échantillons ont été traités de la même manière pour les études à l'échelle nanométrique ou en vrac. Les enquêteurs n'ont pas été aveuglés à l'attribution des groupes lors de la collecte ou de l'analyse des données, car tous les échantillons ont été traités de la même manière pour les études à l'échelle nanométrique ou en vrac. Les images présentées sur les Fig. 1b, c ont été répétées au moins trois fois. Le gel représenté sur la figure 2a a été répété au moins trois fois.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports de recherche sur la nature lié à cet article.

Les ensembles de données générés pendant et/ou analysés pendant l'étude en cours sont disponibles auprès de l'auteur correspondant sur demande raisonnable. Les principaux ensembles de données pertinents générés et/ou analysés au cours de l'étude en cours sont inclus avec le document. Toutes les autres données pertinentes sont incluses dans les informations supplémentaires. Les données sources sont fournies avec ce document.

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Nous remercions Derek Lovley pour avoir fourni la souche. Nous remercions également Jason Baxter (Université Drexel) d'avoir mis à disposition son spectromètre TA pour des mesures préliminaires. Cette recherche a été soutenue par un prix de carrière au Scientific Interfaces du Burroughs Welcome Fund (au NSM), le prix du nouvel innovateur du directeur des National Institutes of Health (1DP2AI138259-01 au NSM) et le prix NSF CAREER no. 1749662 ainsi que le prix EAGER no. 2038000 (à NSM). La recherche a été parrainée par le bureau de recherche de l'armée (ARO) de la Defense Advanced Research Project Agency (DARPA) et a été réalisée sous le numéro d'accord de coopération W911NF-18-2-0100 (avec NSM). Cette recherche a également été appuyée par une subvention All Points West et une bourse de recherche supérieure NDSEG (à la SCC). Cette recherche a utilisé les ressources du Center for Functional Nanomaterials (CFN), qui est une installation utilisateur du Bureau des sciences de l'énergie des États-Unis, au Laboratoire national de Brookhaven sous le contrat n° DE-SC0012704, ainsi que la salle blanche Yale SEAS, le Yale West Salle blanche du campus et noyau d'imagerie du campus de Yale West.

Ces auteurs ont contribué à parts égales : Jens Neu, Catharine C. Shipps.

Département de biophysique moléculaire et de biochimie, Université de Yale, New Haven, CT, États-Unis

Jens Neu, Catharine C. Shipps, Matthew J. Guberman-Pfeffer, Cong Shen, Vishok Srikanth, Sibel Ebru Yalcin et Nikhil S. Malvankar

Institut des sciences microbiennes, Université de Yale, West Haven, CT, États-Unis

Jens Neu, Catharine C. Shipps, Matthew J. Guberman-Pfeffer, Cong Shen, Vishok Srikanth, Sibel Ebru Yalcin et Nikhil S. Malvankar

Département de chimie, Université de Yale, New Haven, CT, États-Unis

Jacob A. Spies, Gary W. Brudvig et Victor S. Batista

Oxford Instruments Asylum Research, Santa Barbara, Californie, États-Unis

Nathan D. Kirchhofer

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JN et NSM ont conçu des expériences en masse tandis que NK, SEY et NSM ont conçu des expériences à l'échelle nanométrique. JN a fabriqué des électrodes et effectué fs-TA avec JAS, JN et CCS ont mesuré la conductivité des nanofils et des biofilms CCS a mesuré les spectres UV-Vis, MJG a effectué des calculs sous la supervision de VSB, CS a développé des biofilms sur des électrodes dans une pile à combustible microbienne et des électrodes fabriquées, VS nanofils de protéines purifiées, NK et SEY ont effectué pc-AFM, GWB a aidé à l'interprétation des données et NSM a supervisé le projet. JNCCS et NSM ont rédigé le manuscrit avec la contribution de tous les auteurs.

Correspondance à Jens Neu ou Nikhil S. Malvankar.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Nature Communications remercie les évaluateurs anonymes pour leur contribution à l'évaluation par les pairs de ce travail. Les rapports des pairs examinateurs sont disponibles.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

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Réimpressions et autorisations

Neu, J., Shipps, CC, Guberman-Pfeffer, MJ et al. Biofilms microbiens comme photoconducteurs vivants grâce au transfert d'électrons ultrarapide dans les nanofils de cytochrome OmcS. Nat Commun 13, 5150 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-32659-5

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Reçu : 03 septembre 2021

Accepté : 09 août 2022

Publié: 07 septembre 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s41467-022-32659-5

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Microbiologie de la nature (2023)

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